范畴的又一打破！刘如谦等人初次完成高效、高纯度的碱基编纂

可编程 C•G 到 G•C 碱基编辑器 (CGBE) 具有遍及的科学和治疗潜力，但其编辑效果已被证明难以猜测，而且其编辑服从和产物纯度每每较低。

2021年6月28日，博德研究所刘如谦，加州大学旧金山分校Britt Adamson及Jonathan S. Weissman在Nature Biotechnology 在线颁发题为“Efficient C•G-to-G•C base editors developed using CRISPRi screens, target-library analysis, and machine learning”的研究论文，该研究形貌了一套与呆板进修模子配对的工程 CGBE，以实现高效、高纯度的 C•G 到 G•C 碱基编辑。

该研究举行了针对 DNA 修复基因的 CRISPR 滋扰 (CRISPRi) 筛选，以确定影响 C•G 到 G•C 编辑效果的身分，并使用这些看法开辟具有差别编辑设置装备摆设特性的 CGBE。该研究在哺乳动物细胞中 10,638 个基因组整合目的位点的库中表征了 10 个有前程的 CGBE，并练习了呆板进修模子，利用这些数据正确猜测编辑效果的纯度和产量 (R = 0.90)。这些 CGBE 可以或许以 >90% 的精度（均匀 96%）和高达 70% 的服从（均匀 14%）校正 546 与疾病相干的颠换单核苷酸变体（SNV）的野生型编码序列。最佳 CGBE-单领导 RNA 对的盘算猜测可以或许在此利用任何单个 CGBE 变体多四倍的目的位点上举行高纯度颠换碱基编辑。总之，这项事情中提出的碱基编辑器和盘算东西大大进步了 CGBE 介导的颠换碱基编辑的靶向范畴、有用性和有用性。

别的，2021年6月2日，博德研究所David R. Liu（刘如谦）等团队在Nature 在线颁发题为“Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice”的研究论文，该研究利用定制的腺嘌呤碱基编辑器 (ABE8e-NRCH) 将 SCD 等位基因 (HBBS) 转换为Makassar β-珠卵白 (HBBG)，这是一种非致病性变异 。将编码碱基编辑器和靶向引导 RNA 的 mRNA 立体递送到 SCD 患者的造血干细胞和祖细胞 (HSPC) 中，导致 80% 的 HBBS 转化为 HBBG。将编辑过的人类 HSPC 移植到免疫缺陷小鼠中 16 周后，HBBG 的频率为 68%，缺氧诱导的骨髓网织红细胞镰状细胞淘汰了 5 倍，评释基因编辑是长期的。为了评估 HBBS 碱基编辑的生理效应，该研究提供了 ABE8e-NRCH 并将 RNA 从人源化 SCD 小鼠导入 HSPC，然后将这些细胞移植到辐射小鼠中。十六周后，Makassar β-珠卵白占血液中 79% 的 β-珠卵白，缺氧引起的镰状细胞淘汰了三倍。与担当未编辑细胞的小鼠相比，担当碱基编辑的 HSPC 的小鼠表现出靠近正常的血液学参数和淘汰的脾脏病理。编辑过的骨髓的二次移植证明了基因编辑在恒久造血干细胞中是长期的，并评释 20% 或更多的 HBBS-to-HBBG 编辑足以举行表型挽救。人类 HSPC 的碱基编辑幸免了在 Cas9 核酸酶处置惩罚后观看到的 p53 激活和更大的缺失。总之，这些发觉评释 SCD 的一次性自体治疗可以消除致病性 HBBS，孕育发生良性 HBBG，并最大限度地淘汰双链 DNA 断裂的不良结果（点击阅读）。

2021年2月19日，博德研究所刘如谦(David R.Liu)及哈佛医学院Dong Min配合通讯在Science 在线颁发题为”Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity“的研究论文，该研究开辟了具有同时阳性和阴性选择的噬菌体帮助卵白酶进化体系，并将其应用于三种肉毒杆菌神经毒素（BoNT）轻链卵白酶。该研究将BoNT / X卵白酶进化为单独的变异体，这些变异体优先裂解囊泡相干膜卵白4（VAMP4）和Ykt6，进化了BoNT / F卵白酶以选择性裂解非自然底物VAMP7，并进化了BoNT / E卵白酶以裂解磷酸酶和肌腱同源卵白（PTEN），但不是神经元中的任何自然BoNT卵白酶底物。进化的卵白酶表现出特异性的大改变（218倍到 11,000,000倍），而且可以保存其形成自我递送至低级神经元的全毒素的本领。这些发觉为重新编程卵白酶创建了通用平台，以选择性地切割具有治疗意义的新靶标（点击阅读）。

单核苷酸变异约占现在已知的人类致病基因变异的一半。碱基编辑器是可编程 DNA 联合卵白与碱基修饰酶的融合，可以或许转换基因组中的单个目的核苷酸 。碱基编辑器的两大类是胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)，将 C•G 转换为 T•A，以及腺嘌呤碱基编辑器 (ABE)，将 A•T 转换为 G•C。CBE 和 ABE 可以高服从和产物纯度（全部编辑的等位基因中仅包罗所需编辑的部门）安置转换突变，但通常无法有用安置转换突变，包罗 C•G 到 G•C。

之前已经证明 CBE 编辑副产品，包罗 C•G 到 G•C 和 C•G 到 A•T 的颠换效果，受到细胞尿嘧啶 DNA N-糖基化酶 (UNG) 地敲除的按捺，评释颠换副产品是由 UNG 催化的脱氨基孕育发生的无碱基中心体形成的。与该模子同等，第一代 CGBE 是缺乏 UGI 域的 CBE 衍生物。这些 CGBE，包罗与 UNG 和其他 DNA 修复卵白融合的编辑器 ，可以提供高效的 C•G 到 G•C 编辑，但仅在少数颠末测试的目的位点上，而且险些没有辨认位点的尺度得当 CGBE 编辑。

曩昔，研究职员利用包罗数千个基因组整合目的位点和哺乳动物细胞中相应指导 RNA 的文库来全面表征 CBE 和 ABE 碱基编辑设置装备摆设。研究职员利用这些数据来练习呆板进修模子（统称为 BE-Hive），该模子进修了驱动 CBE 和 ABE 剑姬编辑效果的序列决定身分。假想对 CGBE 编辑效果的序列决定身分举行遍及表征可以正确猜测编辑服从和产物纯度，从而促进 CGBE 的更遍及利用。

在这里，该研究举行了会合 CRISPR 滋扰 (CRISPRi) 筛选，以辨认影响胞嘧啶碱基编辑服从和纯度的 DNA 修复基因。在这些数据的引导下，该研究构建了种种包罗脱氨酶和 Cas 卵白的融合卵白，这些卵白与 DNA 修复身分融合，以设计具有有远景的 C•G 到 G•C 编辑运动的新 CGBE。

该研究利用由 10,638 个基因组整合、高度可变的小鼠胚胎干细胞 (mESC) 中的靶位点构成的“综合上下文库”对十个具有差别编辑特性的 CGBE 举行了表征。该研究利用所得数据练习呆板进修模子，乐成猜测 CGBE 编辑服从、纯度和观看者编辑模式（CGBE-Hive），从而可靠辨认 CGBE 变体和目的位点，配合支持高纯度 C•G- to-G•C 编辑。别的，该研究评释，与更简洁的模子相比，深度进修模子可以以更高的正确猜测编辑运动，这评释 CGBE-Hive 已经进修了庞大的序列特性，这些特性在确定 C-to-G 编辑运动中起偏重要作用。值得细致的是，CGBE-Hive 猜测将被 CGBE 编辑的 247 胞嘧啶具有 >80% C•G-to-G•C 编辑纯度的确在哺乳动物细胞试验中被编辑，均匀纯度为 83%。

本研究中的 CGBE 提供了多种编辑设置装备摆设特性，配合扩展了得当高质量 C•G 到 G•C 编辑的序列景观，比猜测得当任何单一CGBE编辑的数目超过跨过 4.1 倍。最终，该研究证明白 CGBE 介导的对 546 种疾病相干 SNV 的校正，在得到的编辑氨基酸序列中具有 >90% 的精度。这些发觉促进了对颠换碱基编辑效果的了解，并提供了新的 CGBE，以进步碱基编辑的范畴和服从。

总之，这项事情中提出的碱基编辑器和盘算东西大大进步了 CGBE 介导的颠换碱基编辑的靶向范畴、有用性和有用性。

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