沈彬/娄鑫团队完成斑马鱼线粒体DNA高效精准编纂

责编 | 酶美

线粒体疾病是一类庞大遗传疾病，在美国复活儿中的抱病比率约为1/5000，我国现在尚缺乏完备的线粒体疾病盛行病学资料。现在已知近300个线粒体疾病致病基因，既包罗线粒体DNA（mtDNA）编码的和细胞核DNA（nDNA）编码的。固然mtDNA只编码37个基因，但因为缺乏核小体的爱护，自从1988年第一次报道mtDNA突变造成母系遗传的线粒体疾病以来，到现在已经发觉270余个线粒体DNA突变和线粒体疾病相干。

线粒体疾病涉及神经体系、骨骼肌、心肌等多个构造，患者通常在婴幼儿期发病，多数患儿在成年前会因呼吸体系、心脏等紧张器官功效衰竭而去世亡，是一类严峻危害人类康健的可致残致去世性疾病。因为线粒体疾病致病基因数量较多，致病机制纷纭各别，给临床治疗计谋的研发带来了极大的挑衅，现在尚无有用的治疗药物和治疗本领问世。基因编辑技能的进展为线粒体疾病的研究和治疗带来了曙光。对nDNA突变导致的线粒体疾病，基于CRISPR体系开辟的碱基编辑器和先导编辑器在疾病模子构建和基因治疗方面提供了壮大的东西；但对付由mtDNA突变导致的线粒体疾病，因为CRISPR体系中的指导RNA无法进入线粒体，以上东西对mtDNA突变的模子和基因治疗一筹莫展。2020年7月David R. Liu试验室通过联合伯克霍尔德菌泉源的双链DNA脱氨基酶焦点地区DddAtox和TALE开辟出了针对mtDNA举行编辑的碱基编辑器DdCBE，并在细胞系中实现了C∙G到T∙A的编辑，为mtDNA突变导致的线粒体疾病的动物模子构建和基因治疗提供了大概。

克日，来自南京医科大学-生殖医学国度重点试验室的沈彬试验室和南京大学医学院-模式动物研究所的娄鑫课题组互助在Cell Discovery在线颁发了题为 Precision modeling of mitochondrial diseases in zebrafish via DdCBE-mediated mtDNA base editing 的文章。该研究构建了DdCBE高效组装和筛选平台，在斑马鱼上初次实现可遗传的mtDNA高效基因编辑，并准确模仿人类mtDNA致病突变，为线粒体疾病的致病机制和基因治疗提供了很好的底子。

传统的TALE组装要领耗时费劲，为了可以或许快速组装基于TALE的DdCBE载体，作者构建了192个RVD文库、4个线粒体定位的骨架表达载体和4个审定位的骨架表达载体，通过Golden Gate的要领一步实现DdCBE载体的组装。

为了模仿人mtDNA致病突变G8363A、G3733A和G13513A，通过同源性，设计了针对斑马鱼mtDNA G8892、G4247和G14076位点的NLS-DdCBE载体，以及包罗目标序列的T载体，在HEK293FT细胞上筛选出高效的DdCBE组合。通过在斑马鱼的一细胞期受精卵上注射高效MTS-DdCBE组合的mRNA，乐成构建了携带目的突变的个别，突变率可高达88.32%，而且这些突变可以通过雌鱼通报给子代。携带G4247A和G14076A突变的斑马鱼活动本领明显低落，透射电镜可以观看到突变斑马鱼的线粒体内脊显现严峻伤害。通过全线粒体DNA测序，发觉DdCBE会诱导少量的脱靶，而且这些脱靶位点富集在目的位点的周边，大概是因为TALE联合不稳健导致。

综上，这篇文章构建了DdCBE高效组装和筛选平台，在斑马鱼上初次实现了mtDNA的高效编辑，并准确模仿人类mtDNA致病突变，为进一步研究线粒体疾病的致病机制和药物筛选提供了动物模子，同时也为进一步实验线粒体疾病的基因治疗提供技能平台。

沈彬 博士，南京医科大门生殖医学国度重点试验室研究员。致力于RNA修饰在配子产生历程中的生物学功效研究和新型基因编辑东西的研发，以第一/通讯作者在Cell、Nature Methods、Cell Research、Nature Structure & Molecular Biology等杂志颁发多篇研究论文。接待对配子产生和基因治疗（格外是线粒体疾病基因治疗）感兴趣的优异推免生、硕士生、博士后研究职员参加本试验室。

本文来自BioArtMED微信民众号，更多生物范畴前沿信息等你来发觉！
转载须知
【原创文章】BioArtMED原创文章，接待小我私家转发分享，未经许可克制转载，所登载的全部作品的著作权均为BioArtMED所拥有。BioArtMED保存全部法定权利，违者必究。