剖析细胞内最紧张的能量感觉器和调治器

责编 | 酶美

AMPK（AMP-activated protein kinase）是细胞内最紧张的能量感觉器和调治器，可感知能量状态改变并作出相应，调治多种代谢运动来维持能量天生与斲丧的供需均衡，其底物涉及细胞生长、生殖和代谢历程中的多种要害酶和转录调控因子，是以AMPK功效变态与代谢类疾病如糖尿病、肥胖等，以及癌症的产生都有紧密的干系。

美国温安洛研究所（Van Andel Institute）Karsten Melcher课题组，与包罗中国科学院上海药物研究所徐华强等多个课题组互助，于北京时间2021年7月23日以Structure of an AMPK complex in its inactive, ATP-bound state 为题在Science在线颁发了关于腺苷酸活化卵白激酶（AMPK）的紧张研究结果（闫焱博士为第一作者）。该团队使用Cryo-EM 技能初次剖析了ATP联合状态下的按捺型AMPK复合物的高辨别率布局，论述了AMPK的活性调治机制，提出了AMPK激活、失活、再激活的轮回通路模子。

作为调治能量代谢的开关，AMPK的活性受到细胞能量程度，即腺嘌呤核苷酸（AMP、ADP和ATP）程度的影响。低能状态下，AMP诱导AMPK激活，反之，能量过剩时，ATP竞争性地代替AMP以按捺AMPK活性。固然AMP联合下的激活型AMPK晶体布局早已剖析，但因为ATP联合下的按捺型AMPK具有高度动态性，该布局的剖析事情极具挑衅且困扰了科学家们长达二十多年之久。也正是因为布局信息的缺乏，现在AMPK的活性调治机制尚不明了，很大水平上拦阻了药物发觉的历程。

为了霸占这一困难，美国温安洛研究所Karsten Melcher课题组团结互助团队，起首使用噬箘体展示技能正向筛选了对ATP联合的按捺型AMPK具有高亲和力的抗体，再用AMP联合的激活型AMPK举行反向筛选，清除告终合激活型AMPK的抗体，由此得到了高特异性联合按捺型AMPK的抗体以稳健整个复合物。使用温安洛先辈的冷冻电镜技能，研究团队最终乐成剖析了ATP联合状态下的按捺型AMPK复合物近原子辨别率的冷冻电镜布局。令人惊奇的是，该布局表现了完全差别于激活型AMPK的催化布局域（Kinase Domain，即KD）构象，即空间上举行了180°的扭转和100 Å的位移，导致活化环（Activation loop，即AL）充实袒露，且处于非磷酸化的状态。基于此布局和后续大量的生化阐发，该团队提出了一个多步调机制模子，展现了腺嘌呤核苷酸和药物冲动剂怎样通过转变活化环的磷酸化程度和可及性来调治AMPK活性的全历程。

AMPK是由α、β、γ三亚基构成的异源三聚体复合物，位于α亚基催化布局域上的活化环AL包罗一个焦点磷酸化位点，即α1第174位的苏氨酸（T174）（或α2的T172）。T174的磷酸化会指导AL形成精确构象以完成将磷酸基团从ATP向底物多肽转移的历程，是以T174的磷酸化状态是AMPK活化与否的紧张标记。位于 γ亚基上的CBS3是能量感知位点，可依据能量改变竞争性地联合AMP、ADP或ATP。从激活型AMPK的构象得知，CBS3与AMP联合，且T174被磷酸化，α亚基催化布局域（KD）与β亚基碳水化合物联合域（CBM）相互作用，此时AL处于 “被包裹” 的状态而受到高度爱护，是以卵白磷酸酶难以靠近；而按捺型AMPK的构象则表现，CBS3被ATP据有，且T174未被磷酸化，令人惊奇的是，此时KD完全离开了与CBM的作用，团体举行了180°的扭转和100 Å的位移，AL完全袒露在外，使得上游激酶和卵白磷酸酶可以或许方便靠近它以实现磷酸化或去磷酸化反响。

a, 复合物的冷冻电镜布局图。腺嘌呤核苷酸（插图左）和活化环（插图右）电子云密度图。b, ATP联合且非磷酸化的按捺型布局（左），AMP联合且磷酸化的激活型布局（PDB 4RER, 中）和ATP联合且磷酸化的布局（右）比拟图。

研究团队开展了一系列分子程度的试验阐发，验证了AMPK从激活型到按捺型的构象变化，并证明白造成此改变的“开关”正是AL的去磷酸化。体皮毛互作用（ALPHA Screen）表现，非磷酸化AMPK的KD与γ亚基N真个间隔显着小于磷酸化的AMPK，且AMP进一步收缩、ATP则加长了非磷酸化AMPK中两位点间的间隔，却不影响磷酸化状态的AMPK，此征象大概与AMP指导的后续LKB1激酶联合AMPK以使其重新磷酸化的历程有关。基于卵白质交联质谱（XL-MS）的阐发效果也验证了AMP联合的、磷酸化的AMPK为“KD团结”（KD-associated）构象，而ATP联合的、非磷酸化的AMPK则为“KD离开”（KD-displaced）构象。氢/氘互换质谱（HDX-MS）试验则进一步证明白引起KD构象变化的直接身分是AL的磷酸化状态改变，而非CBS3位点AMP与ATP的置换。为了进一步论述ATP指导去磷酸化的机制，研究团队对AMPK的多部位举行了突变阐发，效果表现β亚基N端CBM和C端支架布局域（CTD）之间的毗连区（β-linker）是使AL受到爱护的要害，起到雷同“护盾”的作用，尔后续的突变阐发和氢/氘互换质谱阐发进一步表现，AMP联合后形成的“CBS3/α-linker/R365联合口袋”以及药物冲动剂联合后形成的“KD/CBM/C端互作螺旋”两种静电相互作用网络均进步了β-linker的稳健性，进而稳健了“KD团结”构象，爱护了AL不被磷酸酶去磷酸；相反，ATP滋扰了AMP形成的作用网络，低落β-linker的稳健性而使AL更简单被去磷酸。

别的，研究团队还开展了细胞程度的AMPK构象变化阐发，用高糖诱导细胞从低能量状态向能量过剩状态举行变化。在此历程中，使用生物发光共振能量转移（BRET）技能检测了AMPK分子内两个被标志氨基酸的间隔改变，该效果验证了AMPK履历了从“KD团结”向“KD离开”的构象变化；同时，使用卵白质免疫印迹法（WB）和液相串联质谱法（LC-MS）分别检测了该历程中AMPK和其底物的磷酸化状态改变以及腺嘌呤核苷酸程度的改变，效果表现，仅在高糖处置惩罚15分钟后，AMPK及其底物ACC的磷酸化程度就明显低落，同时细胞内AMP/ATP、ADP/ATP的比值均明显低落，这些征象与AMPK的构象变化高度同等。

由此，研究团队提出了AMPK从激活、失活到再激活的完备轮回通路模子。完全激活状态下的AMPK、KD和CBM均被磷酸化，AMP和药物冲动剂通过与β-linker两侧地区形成静电相互作用网络而进步了β-linker的稳健性。而能量过剩时，高程度的ATP代替AMP联合在CBS3处，减弱了相互作用网络从而粉碎了β-linker和KD的活性构象，导致AL对磷酸酶的可及性增添。故在此“半激活” 状态下，AL/β-linker和CBM/KD相互作用的去稳健化会进一步增添AL和CBM的去磷酸，导致KD与CBM离开并产生大幅度位移，造成AMPK的完全按捺。而当细胞再次进入低能状态时，AMP重新代替CBS3处的ATP，诱导AMPK的某种构象改变促使上游激酶LKB1对AMPK的AL再度磷酸化。

AMPK激活、失活轮回模子图。完全激活型、磷酸化的状态（左），部门激活型、磷酸化的状态（上）和按捺型、去磷酸化的状态（右）的构象变化。

美国温安洛研究所的博士后闫焱为本文的唯一第一作者，Karsten Melcher传授为通讯作者。同时，该课题得到了包罗中科院上海药物研究所徐华强（H. Eric Xu）课题组、美国芝加哥大学Anthony A. Kossiakoff课题组、美国Scripps研究所Patrick R. Griffin课题组和美国梅奥诊所医学中间Laurence J. Miller课题组的鼎力大举支持。

原文链接：

http://science.sciencemag.org/cgi/doi/10.1126/science.abe7565

制版人：十一

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