王华婷、孙昊研讨组团结构建骨骼肌干细胞体内编纂体系
成体骨骼肌干细胞（muscle stem cell）也被称为卫星细胞（satellite cell，SC），在骨骼肌伤害修复中起要害作用。通常情形下， SC前体细胞形成于诞生前两天左右的小鼠胚胎中，它们在小鼠诞生后不停增殖分解形成肌肉，这平生永劫期被称为少小肌肉生恒久（postnatal myogenesis）【1】，这些活泼增殖状态的细胞也被称为少小期SC（juvenile SC）。在小鼠诞生后2-4周，这些细胞的增殖完结，回来静息状态成为成年小鼠的备用干细胞（Quiescent SC， QSC）。在康健的成年小鼠骨骼肌中，这些QSC位于基底膜下，特异性表达Pax7转录因子，但是当肌肉受到伤害刺激后，会诱导表达肌肉特异性转录因子MYF5和MYOD1，快速激活并进入细胞周期。这些激活的SC（activated SC，ASC）也被称为成肌细胞 (myoblast)。厥后，成肌细胞大量增殖，低落Pax7的表达进一步分解融合形成新的肌纤维。同时，部门成肌细胞会维持Pax7的表达并返回到静息转态以维持SC数目【2】。
比年来，CRISPR/Cas9已被遍及用于种种小鼠模子的构建以及治疗种种遗传疾病【3】。在肌肉体系中，通过腺相干病毒 (adeno-associated virus，AAV)介导的递送，CRISPR/Cas9已被乐成用于治疗杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy ，DMD)。鉴于AAV有限的转载本领（＜4.7 kb），通常情形下Cas9和sgRNA必要被装载到差别的AAV载体中，是以只有同时吸收到二者的细胞核才气被编辑，这也直接限定了编辑的服从。另一方面，这些编辑多是产生在肌纤维中，而SC尤其是QSC可否被CRISPR/Cas9编辑有待进一步的研究。
2021年9月16日，香港中文大学王华婷研究组与孙昊研究组在Stem Cell Reports上团结颁发题为CRISPR/Cas9/AAV9-mediated in vivo editing identifies MYC regulation of 3D genome in skeletal muscle stem cell的研究论文。该文构建了一个可以或许对SC举行体内编辑的体系，并使用该体系展现转录因子MYC可通过影响三维基因组调控SC的激活。
起首，为了便于在体内编辑SC，研究职员构建了可在SC中表达Cas9的小鼠（Pax7Cas9）。Cas9的表达并未对SC的数量、肌纤维的巨细以及骨骼肌的伤害修复孕育发生显着的影响。接下来，研究职员在处于活泼状态的juvenile SC中验证CRISPR/Cas9的编辑成效。为此，研究职员选择Myod1作为典范，使用AAV9将sgRNA通过肌肉注射的方法递送到诞生10天（postnatal 10，P10）的Pax7Cas9小鼠中。在注射4周后，分选出的SC中MYOD1的卵白程度明显低落，当AAV9-sgRNA的剂量高于1×1011 vg时，Western已检测不到MYOD1卵白表达。进一步的测序发觉，编辑服从最高可达95.08%。研究职员又进一步测试了双sgRNA的编辑成效，在雷同剂量下，双sgRNA的编辑服从要略高于单个sgRNA。这些充实证明CRISPR/Cas9可以高效编辑juvenile SC。
厥后，研究职员进一步验证CRISPR/Cas9是否可以或许编辑处于静息状态的QSC。为此，他们构建了可在SC中诱导表达Cas9的Pax7ER-Cas9小鼠。相较于Pax7Cas9小鼠，在Pax7ER-Cas9小鼠中Cas9的表达可通过他莫昔芬（Tamoxifen，Tmx）操纵，从而将CRISPR/Cas9编辑限定在QSC中。研究职员接纳了3种差别的计谋，但遗憾的是均未能有用编辑QSC。
接下来，研究职员进一步将该体系用于编辑其他SC中的要害转录因子（key transcription factor，key TF），以探究它们在SC中的功效。已有的研究证明【4】，要害转录因子的表达受到超等加强子（super enhancer，SE）的调控，而要害转录因子又可联合到超等加强子上调控其功效。使用这一特性，研究职员起首在SC中分别猜测了一系列大概调控SC静息以及激活的要害转录因子。作为此中一个因子，Myc被编辑后，其卵白程度显着低落，编辑服从高达83%。功效上，Myc编辑导致SC的激活明显低落，而骨骼肌伤害修复也被明显按捺。最终，研究职员又进一步探究了MYC调控SC激活的潜伏机制。通过Hi-C，研究职员发觉Myc编辑导致三维基因组显着转变，同时陪同着基因表达程度的转变，表示MYC大概通过调控三维基因组进而调控基因表达，从而影响SC的激活。
总而言之，这项研究初次展现了CRISPR/Cas9/AAV9-sgRNA体系可以高效编辑处于活泼状态的juvenile SC，但不克不及编辑处于静息转态的QSC。该体系可用于编辑研究SC中调控因子的功效。相较于传统的构建基因工程小鼠的要领，该体系大大低落了体内敲除特定基因所必要的时间和精神，尤其是必要同时敲除多个基因时，该体系更具上风。别的，不但仅是编码基因，该体系也可用于非编码基因功效的研究。
香港中文大学化学病理系博士后何良强，博士生丁英哲，矫形外科与创伤学系博士后赵喻（现为中山大学副传授）是该研究结果的配合第一作者。矫形外科与创伤学系王华婷传授与化学病理系孙昊传授是该论文的配合通讯作者。
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