基果暗码子扩展技能，医治无义渐变稀有病

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稀有病，又称为“孤儿病”，普通为慢性的严峻性疾病，常危及生命。稀有病种类已达8000多种，只有不到1%的疾病具有可行的治疗方案，此中80%以上的稀有病是由遗传身分导致的，50%以上的稀有病会在诞生时和儿童期发病并导致去世亡。中国约2000万的稀有病患者，且每年新增患者凌驾20万。而遍及漫衍的稀有病，如苯丙酮尿症、β地中海血虚、杜氏肌营养不良症等，多为单基因遗传病，即由单个基因突变导致的遗传性疾病。

杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)，简称DMD，是一种X染色体隐性遗传病，由编码肌营养不良卵白的基因突变引起，重要在男孩中发病，突变中约有10%是无义突变范例，即编码氨基酸的暗码子突变为提前停止暗码子（premature termination codon, PTC），属于PTC疾病。据统计，环球均匀每3500个复活男婴中就有一人罹患此病，我国的发病率高于此比例。患者普通在3-5岁开始发病，最早体现出举行性腿部肌无力，导致未便行走。12岁时失去行走本领，20岁-30岁因呼吸衰竭而去世亡。现在该病尚无有用的治疗要领。

基因暗码子扩展技能使用停止暗码子编码人工合成氨基酸（unnatural amino acid, UAA）的前沿生物技能，可精准的用于PTC位点引入UAA，而不影响卵白正常停止暗码子的翻译功效。此项技能重要利用aaRS（aminoacyl-tRNA synthetase）/tRNA正交体系在产生无义突变的位点通读突变暗码子，到达翻译全长卵白的治疗目标。

北京大学药学院夏青传授在生命科学相干范畴有着多重交织学术配景，所涉及偏向有临床医学、免疫学、神经科学、无机化学及生归天学，具有敏锐且新鲜的科学研究视角，驻足前沿生物技能范畴，面向医学和生命科学紧张题目。

2021年8月2日，夏青团队在Natural Biomedical Engineering在线颁发了文章“Restoration of dystrophin expression in mice by suppressing a nonsense mutation through the incorporation of unnatural amino acids”，该研究初次实现了使用基因暗码子扩展技能规复内源性Dystrophin卵白的全长表达，在肌肉干细胞和PylRS/mdx小鼠疾病模子上体系评价了该要领用于治疗DMD的宁静性、有用性和可行性，并完成了差别方法递送AAV-PylRS-tRNAPyl的宁静性和治疗成效评价，为DMD和无义突变稀有病治疗提供了新计谋。此项研究已于2016年报告中国和美国专利，现在正积极投入临床前试验研究中。

在本课题中，研究者选择了吡咯赖氨酸体系PylRS-tRNAPyl，该体系可以将非自然氨基酸NAEK定点插入到卵白质。研究者起首拓展了可以通读3种提前停止暗码子（TAG、TGA与TAA）的PylRS-tRNAPyl体系，在HEK293T细胞中 验证非自然氨基酸NAEK依靠性和正交性。然后，研究者构建了含差别PTC位点的dystrophin模子卵白Dp71b，将其质粒与PylRS-tRNAPyl体系质粒配合转染给HEK293T细胞，证明3种正交体系均可通读模子卵白Dp71b。进一步，研究者在从疾病模子mdx小鼠和DMD病人分散得到的肌肉分解干细胞上举行验证，均检测到dystrophin卵白的表达规复，开端验证PylRS-tRNAPyl体系可以在细胞程度规复内源Dystrophin卵白的全长表达。

在动物层面上，研究者起首实验将PylRS-tRNAPyl质粒直接电穿孔转染到小鼠的胫前肌中，dystrophin可规复少量表达，开端评释了该要领可以在mdx小鼠上规复内源卵白表达。为进一步评价该要领用于DMD疾病差别构造的恒久治疗成效，办理电转对小鼠构造的伤害和质粒降解题目，研究者创新性的创建了含有编码新型氨基酸的PylRS-tRNAPyl正交转基因小鼠，将其和发病mdx小鼠交配得到PylRS/mdx转基因疾病小鼠模子，此模子可以稳健表达PylRS/tRNAPyl体系并出现mdx小鼠雷同的dystrophin缺陷，是以得当恒久治观看疗效。对小鼠举行8周的腹腔注射NAEK，在第1, 2, 4, 6, 8周分别对小鼠举行握力测试，肌肉构造dystrophin卵白表达量检测，血液生化检测，构造病理染色阐发及宁静性评价。效果发觉试验组小鼠在注射NAEK第4周后卵白规复量到达平台期（30%左右），与对比组小鼠相比，第4, 6, 8周试验组小鼠的握力显着增添，CK激酶含量降落，肌肉构造的正常肌细胞的比例显着上升，评释该要领可规复小鼠dystrophin卵白全长表达及其部门生理功效，治疗成效明显，远优于小分子通读药物治疗。

最终，为评价该要领推向临床治疗应用的可行性/可转化性，研究者用AAV作为载体构建了AAV-PylRS-tRNAPyl体系，以腹腔注射和肌肉注射两种方法，分别评价其在mdx小鼠上的满身/局部治疗成效，两种方法注射AAV-PylRS-tRNAPyl均有显着治疗成效，均出现出NAEK依靠性，可以通过停用或调解非自然氨基酸的用量来操纵基因治疗的成效，有望实现精准的可控治疗。

综上，本项研究使化学家创建的体外卵白质定点标志技能突破性的走进医学的天下，实现了在体内恣意氨基酸的精准更换，拓展了人工合成氨基酸在生物医学中的宽阔应用远景。而且初次实现人工氨基酸正交翻译体系在无义突变疾病中的试验性治疗，这是继小分子通读药物、单碱基基因编辑之后的第三种通用治疗稀有病的要领，有望引领新一代生物治疗的医学前沿阵地。

北京大学药学院夏青课题组研究生史宁宁、杨琦，博士后张浩然为该论文的配合第一作者，夏青传授为通讯作者。