聚己内酯纤维构造正在体表里驱动巨噬细胞极化并调治肌腱炎症活化

Biomaterials：宏观力学和聚己内酯纤维构造在体表里驱动巨噬细胞极化并调治肌腱炎症活化

DOI:10.1016/j.biomaterials.2020.120034

得当的巨噬细胞对植入生物质料的相应对付构造愈合的乐成至关紧张。在这项事情中，研究了电纺生物质料和外部机器载荷的内涵拓扑线索怎样协同指导巨噬细胞活化以及巨噬细胞-肌腱成纤维细胞的串扰效应。在机器加载和未加载的条件下，利用定向或随机取向的聚己内酯纳米纤维基质举行了一系列的体外和体内试验。在全部试验中，无序的生物质料纤维形态足以促进巨噬细胞、肌腱成纤维细胞和肌腱构造中的促炎信号。研究发觉外部机器负荷通过在体内和体外淘汰促炎性标记物来猛烈调治该标记的特性。研究者观看到，与肌腱成纤维细胞相比，巨噬细胞通常表现出对生物物理线索的更强相应，在机器共造就模子中观看到这些细胞范例之间的串扰效应尤为明显。总的来说，这些研究数据评释巨噬细胞在肌腱修复中作为机器觉得细胞发挥着潜伏的紧张作用，并提供了对公道的生物质料设计怎样治疗性调治生物学反响的看法，这些设计可以办理召募细胞的生物力门生态位。

图1：在体外，随机取向的基底促使巨噬细胞向加强的促炎表型极化。（A）SEM图像表现附着在随机（左图）和定向（右图）PCL基质上的巨噬细胞之间的形态学差别，均匀纤维直径为700 nm，在定向基底上有细长的细胞。（B）在随机（棋盘格）和定向（白盒）基底上造就的M0巨噬细胞中，CCR7（M1样）和MRC1（M2样）的基因表达程度相似。在随机取向的纤维上造就的细胞中，检测到IL1B的表达显着增添，而TNF和TGFB1的表达程度连结稳定。（C）流式细胞仪阐发表现，假如在随机基底上造就，则M0巨噬细胞向促炎（CCR7+）表型极化。通过丈量在随机分列的PCL纳米纤维基底上造就的M0巨噬细胞中CCR7（赤色点）和MRC1（绿色三角形）阳性细胞的百分最近举行评估。（D）袒露于差别地形线索的巨噬细胞中的细胞因子排泄表现出在随机基底上造就的细胞中促炎性细胞因子TNF的卵白质开释明显增添。数据表现为n=6（B）、5（C）、3（D）的中位数，且具有四分位数范畴，而且当*P≤0.05时，评释数据具有明显性差别。通过双向方差阐发与Tukey的多重比力测试举行统计学阐发，以评估两组之间基因表达程度的统计学差别。别的，举行了带有Dunn过后查验的KruskalWallis非参数方差阐发，将每种治疗要领与其对应的对比组（TCP上的M0）举行比力（C，D）（*P≤0.05，***P≤0.001，****）P≤0.0001）。比例尺代表50µm（放大倍数）。

图2：动态加载M0巨噬细胞在体外诱导向促炎性M1样表型的极化变化。（A，B）机器负荷会上调M0巨噬细胞中CCR7（M1标志）的表达。因为动态负载，CCR7明显增添，而MRC1基因表达连结稳定（n=9）。（C）与未负载的对比组（随机基底上的M0）相比，CCR7阳性细胞的百分比评释动态负载细胞群中的极化移位（n=6）。（D-F）别的，与静态负载条件相比，动态负载下测定炎性细胞因子IL1B、TNF和TGFB1的基因表达程度。效果通过此中位数归一化为随机无负载基质上的M0巨噬细胞（n=9）。利用Kruskal Wallis非参数ANOVA与Dunn过后查验举行统计学阐发，比力每种治疗要领及其相应的对比组（随机或对齐的PCL上的M0）举行比力（*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001）。

图3：体外巨噬细胞条件造就基（CM）刺激的hTFs的免疫反响。（A）利用多重ELISA在上清液中丈量机器调治的巨噬细胞中的细胞因子排泄。在机器负载（1%和7%菌株）和未负载巨噬细胞（n=6）的上清液中丈量IL-6、TNF、IL1β和IFN-γ的程度。（B） 将hTFs接种于经促炎性巨噬细胞条件造就基（CM-M1）刺激的F-actin（赤色）和NF-κB-p65（绿色）染色的定向基质上（虚线表现细胞核的位置）。（C） 对p65的免疫染色表现，动态负载巨噬细胞受CM刺激的hTFs中核p65明显增添。在随机基底上造就的未负载M0巨噬细胞条件的造就基作为对比组（n=4）。（D）基因表达阐发展现了机器负载巨噬细胞受CM刺激的hTFs中MMP1的较低表达。在受CM刺激的hTF中，肌腱基因表达和成纤维细胞活化的标志无明显改变。别的，在袒露于机器负载巨噬细胞造就基的hTFs中，发觉炎性细胞因子TNF和IL1B的表达程度明显低落（n=6）。利用Kruskal Wallis非参数ANOVA和Dunn过后测试举行阐发，比力每种治疗要领及其相应的对比组（未负载M0的CM）（*P≤0.05，**P≤0.001）。比例尺代表20µm。

图4：机器负荷可防备IL1B在体外激活NFκB。（A） 核长宽比的量化评释，随着负荷的增添，核形状的延伸率明显增添，在定向基底（白盒）上造就的细胞中标志更显着（n=3）。（B）hTFs的动态负载导致核p65的存在增添。这种效应在随机接种的细胞（棋盘格）上比在定向（白盒）基质（n=6）上更显着。（C） 机器刺激后用IL1B举行促炎性刺激可明显淘汰p65亚单元易位（n=6）。采纳Kruskal-Wallis非参数ANOVA和Dunn过后测试举行统计学阐发，比力每种治疗要领及其相应的对比组（PCL上的M0随机或对齐，无负荷）（P≤0.05，**P≤0.01，**P≤0.001）。

图5：M0和hTF的直接共造就可增添hTF中核NFκB-p65的易位。（A）在定向PCL基底上造就的M0巨噬细胞和hTF的免疫荧光染色，对F-肌动卵白（赤色）、DNA（蓝色）和NFκB-p65（绿色）举行染色。（B）对hTF中NFκB-p65的核转运举行定量阐发表现，与M0巨噬细胞共造就时，其程度明显增添。然而，在机器刺激条件下，核p65含量较低（n=5）。（C）利用CD14和CD90染色，通过流式细胞术检测细胞群。CD14阳性和CD90阴性细胞表现巨噬细胞，而CD90阳性和CD14阴性细胞表现肌腱成纤维细胞。（D）CD14+/CD90-细胞极化标志物CCR7+（M1型标志）和MRC1+（M2型标志）的进一步门控评释，假如在直接共造就中袒露于7%动态负荷下，则有向抗炎巨噬细胞极化的趋向。MRC1+/CCR7+细胞之间的比例表现，在动态负载的共造就条件下（n=6），MRC1+阳性细胞的比例明显增添。详细而言，对付M0单造就，CCR7+细胞的百分比为4.5%，对付M0+hTF共造就，为4.32%，对付动态负载共造就，为4.745%。对付MRC1+细胞，测定了2.45%为单造就，2.14%为共造就以及4.7%为动态负载共造就。利用KruskalWallis非参数ANOVA与Dunn过后查验举行统计阐发，比力每种治疗要领及其相应的对比组（分别为hTF，未负载或M0在PCL上对齐，未负载）（*P≤0.05，**P≤0.01）。比例尺代表20µm。

图6：PCL支架与体内差别纤维构造的构造整合。（A，B）植入大鼠跟腱后7天，随机取向（上图）和定向（下图）支架的抗CD68染色。核染色（DAPI，归并，右图）表现了两种构建体中都有大量宿主细胞，而抗CD68染色（粉赤色，左图）定性评释在随机取向的样品中免疫细胞笼罩了更多/更大的地区。A和B中的黄色虚线（星号）表现支架在构造中的位置。比例尺代表100 µm。（C）每单元面积细胞数目的半定量阐发评释，随机取向的纤维支架四周和随机染色的免疫细胞数目改变很大，与体表面察效果同等，机器卸载和纤维解离促进了促炎信号。利用Kruskal Wallis非参数ANOVA和Dunn的多重比力查验举行统计阐发，以评估两组之间的统计差别（p=0.333）。

图7：促炎细胞因子排泄对体内电纺纤维分列和肌肉气力敏感。安排在未治疗动物的肌腱中的随机取向（A）和定向（B）支架（虚线之间，星号）的代表性图像，并用IL-1ß抗体染色（IL-1ß-左图中的赤色信号，右图为IL-1ß信号、DIC和核染色的归并）。（C）构造切片上IL-1ß表达的半定量阐发。宿主细胞植入定向支架后，IL-1的排泄显着增添。采纳Mann-Whitney试验举行统计阐发，分别比力动态负载（未处置惩罚）和未负载（肉毒杆菌处置惩罚组）组的定向支架和随机支架（*P≤0.05）。比例尺代表100μm。

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文章泉源：易丝帮